پایان نامه بررسي ميزان ATP در اسپرم مولدين نر ماهي كفال طلايي Mugil auratus
چکیده
کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلاتی این دریا می باشند.که پس از انتقال از دریای سیاه به دریای خزر، توانستند خود را بااکوسیستم این دریا مطاقبت دهند.
هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط زمانی،دمایی و محلولهای تداوم بخش (Extender) مختلف بوده است. بدین منظور میزان ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دماهای مختلف (°C12- 10،20 -18)، میزان ATPاسپرمهای نگهداری شده دردماهای مختلف (°C 4،Room temperature ) به مدت 6 ساعت، میزان ATP اسپرمهای نگهداری شده در محلولهای تداوم بخش (extender)مختلف (گلیسرول، محلول نمک 7/0% ، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 روز، میزان ATP اسپرمهای نگهداری شده در همان شرایط به مدت 10 روز، به روش فوق حساس بیولومینوسانس اندازه گیری گردید.
براساس آزمایشات انجام شده در این تحقیق، غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای °C 12- 10، 22/7 ± 04/74درصد غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای °C20- 18 بود.اسپرمهای نگهداری شده در دمای °C 4 یخچال به مدت 6 ساعت و اسپرمهای نگهداری شده در دمای آزمایشگاه به مدت 6 ساعت به ترتیب 91/0 ± 26/90 درصد و 49/1 ± 17/17 درصد ATP خود را حفظ کردند. نگهداری اسپرم درextender های مختلف (گلیسرول، محلول نمک 7/0% ، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک 65/0%، درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند. نگهداری اسپرم درهمان extenderها به مدت 10 روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد. اسپرمهای نگهداری شده در گلیسرول در دمای °C 15- بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده در گلیسرول در دمای °C 15- بعد از 10 روز به ترتیب 5/4 ± 19/74 و 2/6 ± 67/47 درصد ATP خود را حفظ کردند. اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 7/0% در دمای °C 1 بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 7/0% در دمای °C 1 بعد از 10 روز به ترتیب 81/2 ± 65/13 و 06/0 ± 69/0 درصد ATP خود را حفظ کردند. اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 65/0% در دمای °C15- بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده درمحلول نمک 65/0% در دمای °C 15 – بعد از 10 روز به ترتیب 68/6 ± 58/73 و 12/0 ±05/1 درصد ATP خود را حفظ کردند.
براساس نتایج به دست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی، نمونه گیری در دمای °C20- 18 و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.
مقدمه
اسپرم عامل مهم تولیدمثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی مانند توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرمهای متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزانATP و فاکتورهای شیمیایی و بیوشیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولیدمثلی برخی جانداران از جمله آبزیان کمک می کند. هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط دمایی ، زمانی و محلولهای تداوم بخش مختلف می باشد. تاکنون تحقیقات گسترده ای توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP اسپرم ماهیان نسبتأ محدود است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد.
اسپرم به کمک حرکت ضربه ای تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت ازطریق هیدرولیز ATP فراهم می شود(Billard et al, 1999 ).تحرک اسپرم به میزان ATPذخیره ای اولیه (Christen et al, 1987) و میزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (Lahnsteiner et al, 1999 ) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند، ATP سنتتاز قادر به نگهداری نسبتهای بالای ATP هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست، لذا میزان ATPبه سرعت کاهش می‌یابد. این کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است (Christen et al, 1987 و Perchec et al, 1995). تفاوت قابل توجهی بین گونه‌ها در مقدارATP مورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(Mansour et al, 2003 ).
در این مطالعه میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط مختلف دمایی نمونه گیری (10-12و 18-20 درجه سانتیگراد) و نگهداری 6 ساعته در دماهای مختلف ( دمای اتاق و 4 درجه سانتی گراد) در محلولهای تداوم بخش مختلف( گلیسرول، محلولهای نمکی 65/0 و 7/0 درصد) در زمانهای متفاوت ( 5 روز و 10 روز) به کمک روش فوق حساس بیولومینوسانس مورد اندازه گیری قرار خواهد گرفت.
فصل اول:
مروری بر تحقيقات گذشته
1- 1 پیشینه تحقیق
امروزه کشورهای پیشرفته به دلیل تلاش بیشتر و برخورداری از امکانات پیشرفته تر، در زمینه ویژگیهای اسپرم ماهیان و عوامل موثر بر آن تجارب زیادی کسب نموده اند. اطلاعات بدست آمده عمدتأ در مورد ماهیان پرورشی می با شد. دراین مورد کارهای تحقیقاتی زیادی انجام شده است و مطالعات گسترده ایی در خصوص عوامل تاثیرگذار، استرس زا و یا آلوده کننده صورت گرفته نتایج حاصله با یکدیگر مقایسه شده اند. به مواردی از این پژوهشها در ذیل اشاره شده است.
ماهیان آبشش آبی نر به دو شیوه تولید مثل می کنند. برخی از نرها که parental نام دارند تولیدمثلشان تا سن 7 سالگی به تاخیر می افتد، اما گروه دیگر (sneaker) زودتر بالغ میشوند. طبق مطالعات Burness و همکارانش در سال 2004 در هر دو شیوه تولیدمثلی، سرعت حرکت اسپرم و سطوح ATP در 60 ثانیه اول تحرک اسپرم به موازات هم کاهش می یابد. اگرچه میزان ATP اولیه اسپرم ماهیان sneakerنسبت به ماهیان parental بیشتر است ولی بین شیوه های تولید مثلی آنها تفاوتی وجود ندارد. ضمنأ از لحاظ سرعت حرکت اسپرم، درصد اسپرمهای متحرک یا فعالیت آنزیمهای متابولیک بین شیوه های تولیدمثلی تفاوتی وجود ندارد. هرچند اسپرم ماهیان parental تا حدودی نسبت بالاتری از کراتین فسفوکیناز را نسبت به سیترات سنتاز دارا می باشند. در هر دو شیوه با افزایش فعالیت کراتین فسفوکیناز و سیترات سنتاز، میزان ATPاسپرم افزایش (Burness et al, 2004) می یابد.
طبق گزارشات Kruger و همکارانش در سال 1983 میانگین مدت زمان تحرک اسپرم کپورماهی معمولی Cyprinus carpio به فصل وابستگی داشته و حدودا 2/1 تا 6/1 دقیقه است Kruger et al , 1983)). ماکزیمم مدت زمان تحرک اسپرم کپورماهی معمولی 2 دقیقه است 1984) ، .( Koldras and Moczarsk در کپورماهی، اسپرم و ادرار از یک مجرای تناسلی آزاد می شوند لذا ممکن است اسپرم جمع آوری شده از آن توسط ادرار آلوده شود. طبق مطالعات Perchec و همکارانش در سال 1998 درصورت آلوده نشدن اسپرم ماهی به ادرار، میزان ATP اسپرم حدود nmol 9 – 8 به ازاء 108 اسپرم و سرعت ابتدایی آن حدود s/ mm 160 – 100 و فرکانس ضربه تاژکی حدود㎐ 50 – 30 اندازه گیری شد. اما، وقتی
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چكيده————————————————————-1
مقدمه—————————————————————3
فصل اول : مروري بر تحقيقات گذشته
1-1 پيشينه تحقيق—————————————————- 5
1-2 تاكسونومي—————————————————– 7
1-3 مشخصات كلي راسته كفال ماهي شكلان ——————————– 8
1-4 مشخصات خانواده كفال ماهيان ————————————– 9
1-5 مشخصات كفال طلايي ——————————————– 9
1-6 زيست شناسي كفال طلايي —————————————– 10
1-6-1 مشخصات زيستي كفال طلايي————————————- 11
1-6-1-1 تحمل درجه حرارت—————————————— 11
1-6-1-2 تحمل شوري ———————————————- 11
1-6-1-3 تحمل مقادير اكسيژن —————————————– 11
1-6-1-4 تغذيه كفال طلايي ——————————————- 12
1-7 ارزش اقتصادي كفال ماهيان —————————————– 12
1-8 ارزش غذايي ماهي كفال ——————————————- 13
1-9 پراكنش كفال ماهيان ———————————————- 14
1-10 درياي خزر—————————————————- 16
1-11 توليد مثل كفال طلايي ——————————————– 18
1-11-1 دستگاه توليد مثل كفال طلايي ———————————— 19
1-11-2 اسپرماتوژنز ————————————————- 21
1-11-3 ساختمان اسپرماتوزوئيد —————————————- 21
1-11-4 فعاليت اسپرماتوزوئيد —————————————— 22
1-11-5 رابطه بين ميزان ATP و تحرك اسپرم —————————— 23
1-11-6 مكانيزم چرخشي انتقال انرژي در ATP سنتاز ———————— 23
1-11-7 AMP حلقوي بعنوان يك پيامبر ثانويه —————————— 26
1-11-8 محلولهای تداوم بخش یا extenders —————————– 31
فصل دوم: روش تحقيق و مواد
2-1 مواد و وسايل مورد نياز ——————————————– 35
2-1-1 خصوصيات كيت تعيين ATP ———————————— 36
2-1-2 اجزاي كيت تعيين ATP —————————————– 36
2-1-3 روش آماده سازي محلولها ————————————— 37
2-1-4 خصوصيات و كاربردهاي بافر HEPES —————————– 37
2-1-5 روش آماده سازي محلول بافر HEPES—————————— 38
2-1-6 روش آماده سازي محلول بي كربنات سديم ————————— 38
2-1-7 روش آماده سازي محلول گليسرول 10% و گلوكزM 3/0 —————- 38
2-2 روش كار —————————————————– 38
فصل سوم : نتايج تحقيق
نتايج ————————————————————- 44
فصل چهارم: بحث و نتيجه گيري و پيشنهادات
بحث و نتيجه گيري ————————————————— 56
پيشنهادات ——————————————————— 62
پیوست———————————————————— 63
منابع فارسي ——————————————————– 89
منابع لاتين———————————————————- 90
چکیده انگلیسی—————————————————— 94
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1 ——————————————————– 27
جدول 3-1——————————————————— 45
جدول 3-2——————————————————— 45
جدول 3-3——————————————————— 46
جدول 3-4——————————————————— 46
جدول 3-5——————————————————— 47
جدول 3-6——————————————————— 47
جدول 3-7——————————————————— 47
جدول 3-8——————————————————— 49
جدول 3-9——————————————————— 49
جدول 3-10——————————————————- 49
جدول 3-11——————————————————- 54
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار1———————————————————— 45
نمودار 2———————————————————– 46
نمودار 3———————————————————– 48
نمودار 4———————————————————– 50
نمودار 5———————————————————– 51
نمودار 6 ———————————————————- 52
نمودار 7———————————————————– 53
فهرست اشكال
عنوان صفحه
شكل 1-1 ——————————————————— 9
شكل 1-2———————————————————- 10
شكل 1-3———————————————————- 15
شكل 1-4———————————————————- 21
شكل 1-5———————————————————- 24
شكل 1-6———————————————————- 29
شكل 1-7———————————————————- 30
شكل 2-1———————————————————- 37
شکل 2-2———————————————————- 41
پایان نامه بررسي ميزان ATP در اسپرم مولدين نر ماهي كفال طلايي Mugil auratus