فایل مارکت

تحقیق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7L12 و P39 در موشهاي Balac

فصل دوم

هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت.

1- لكون نمودن ژنهاي فوق در يك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعيين ترادف نوكلئوتيدي ژنهاي جداشده و مقايسه آن با ژنهاي L₇/L₁₂

3- كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوني Procaryotic expression vector

4- توليد و تخليص پروتئينهاي L₇/L₁₂ و P39

5- كلون نمودن آنها در پلاسميد بيان كننده اوكاريوتي Eucaryotic expression vector

6- هاري كردن پلاسميدهاي فوق از آندوتوكسين

7- تزريق پلاسميدها، بسويه واكنش و سويه بيماريزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهاي ايمونولوژيك

باكتريها و پلاسميدهايي كه براي انجام اين پايان نامه استفاده دشه اند بترتيب زير مي باشند:

باكتريها: بروسلاآبورتوس سويه هاي 19S و 544 اشديشيالكي سويه

اشريشيالكي سويه BL21 – اشريشياكي سويه BL21(DE3(Plyss

پلاسميرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3

• جداسازي كروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:

براي تكثير ج داسازي ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 ابتدا كروموزوم باكتري جداسازي گرديد.

مواد:

بافر TE:

Tris – Hel             10mm

EDTA                  1.0mm

‍PH بافر را پس از تهيه برروي 8 تنظيم مي نمائيم.

پروتئيناز K:

CTAB/NaCl:

Nacl                      4.1gr

CTAB                  10gr

DDW                    100ml (Final Volume)

روش:

ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه 19S تلقيح مي نمائيم. پس 48 تا 72 ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است:

1- 5/1 ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت 2 دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.

2- Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي ⁰C37 نگهداري مي نمائيم.

3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت 10 دققيق در  ⁰C65 انكوبه مي كنيم.

4- هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم – ايزوآميل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.

5- هم حجم محلول روئي ترميب فنل – كلروفرم – ايزوآميل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.

6- هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.

7- رسوب DNA كروموزومي را با الكل 70% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.

بررسي كمي و كيفي DNA كروموزومي:

براي تعيين خلوط كروموزوم باكتري از مواد و وسايل زير استفاده ميشود.

1- بافر PBE   pH=8(10X)

Tris – base                               890mM

Boric Acid                               890mM

EDTA                                      25mM

2- آگارز MP

3- تانك الكتروفورز افقي

روش:

ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بكمك حرارت حل كرده و ژل آگارز افقي را سيني مخصوص تانك الكتروفورز افقي تهيه مي نمائيم. سپس به مقدار Ml5 از DNA كروموزومي را در چلهك ژل ساخته شده ريخته و در تانك الكتروفورز حاوي بافر TBE(0.5x) پس از برقراري جريان الكتريكي مستقيم الكتروفورز مي كنيم.

بريا تعيين مقدار DNA نيز پس از تهيه رقت  تز كروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گيري مي نمائيم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عكس رقت  50  DD قرائت شده = مقدار DNA تعيين مي گردد.

– مرحله پس از جداسازي كروموزوم تكثير و جداسازي ژنهاي مورد نظر است. اين فرآيند با استفاده از دستگاه PCR انجام مي گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پايه اي، ژن مورد نظر را مي توان با استفاده از آنزيم تك پلي مرآز Tag Polymerase تكثير نمود. عوامل پايه اي ذكر شده شامل موارد ذيل است.

1- قالب

2- پرايمر جلو Forward

3- پرايمر عقب Revers

4- دروكسي نوكلئوتيدها LNTP

5- منيزيوم

6- بافر

7- آنزيم پلي مرآز

8- آب مقطر استريل

براي تهيه پرايمرها ابتدا بايد آنها را طراحي كرد. براي طراحي پرايمرهاي ژن L₇/L₁₂ و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتيدي ژنهاي فوق را از مركز اطلاعاتي NCBI بدست مي آوريم.

accession No(L₇/L₁₂). L27819

accession No(P39). L35038

سپس بر اين اساس و درنظر گرفتن نكات استاندارد طراحي پرايمر از جمله طول پرايمر، دماي اتصال G+C%، توليد پرايمر، توليد لوپ يا حلقه و … ترادف پرايمرهاي تعيين ميگردد. در اين مرحله از آناليزهاي كامپيوتري توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده ميگردد.

ترادف ژن مورد نظر و پرايمرهاي Forward و Reverse براي جداسازي ژنهاي فوق از باكتري بروسلا به شرح زير است:

• پرايمرهاي L₇/L₁₂

Forward:

5’ GGA AAT   GCT GAT CTC GCA AA3’

Revers:

5’ CCA    CTT  GAG  TTC AAC XTT   GGC  CA3’

2- پرايمرهاي P39

Forward:

5’ GCC     GGC   GCC   TGT   TGC   CAA 3’

Reverse:

5’ C CGC    TTT  TGC   GGC   TTC   AA  3’

جهت سهولت مراحل كلونينگ و با توجه به محلهاي ممكن براي كلون سازي در پلاسميدهاي حد واسط و پلاسميدهاي بياني دو جايگاه آنزيمي BamHI و XhoI درابتدا و انتهاي پرايمر طراحي شده است. پرايمرهاي طراحي شده توسط شركت MWG آلمان ساخته شد.

براي انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. براي بهينه سازي تكثير ژنهاي ذكر شده غلظتهاي مختلف يون منيزيم (از 5/1 تا 5/3 ميلي مولار) و دماهاي مختلف مناسب براي اتصال پرايمرها با DNA كروموزومي (66-63 درجه سانتيگراد) بكار رفته است.

– تائيد ژنوم سنتز شده توسط PCR:

براي تاييد صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزيمي ژنهاي فوق استفاده مي گردد. چنانچه از هضم آنزيمي ژن L₇/L₁₂ با آنزيمهاي EC0RI و Hind III بترتيب قطعات (168+206) و (305+69) بايد ديده شود و از هضم آنزيمي ژن P39 با آنزيمهاي NEOL و Hind III بترتيب قطعات (136+560+709) و (553+652) بايد ديده شود.

براي تاييد نهايي صحت ژنهاي تكثير شده از نظر ماهيت و ترادف نوكلئوتيدي آنها، اين ژنها ابتدا در ناقل pSK⁺ كلون گرديد و سپس براي تعيين سكانس به شركت مربوط ارسال گرديد.

– كلونينگ ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 در كلونينگ pSK⁺:

براي كلونينگ ژنهاي فوق ابتدا بايد ژنها تحت اثر آنزيمهاي BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسميدي pSK نيز با آنزيمهاي اخير برش داده شود.

1- برش آنزيمي ژنهاي L₇/L₁₂ و P39 با آنزيمهاي BamHI و xhoI.

• برش آنزيمي پلاسميد pSK با آنزيمهاي BamHI و xhoI پلاسميد pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. اين پلاسميد داراي يك ناحيه تكثيري ColE1، يك ناحيه مقاومت به آمپي سيلين تحريك ناحيه f1 origin و يك ناحيه بنام multiple cloning site=MCS كه جايگاه تعدادي از آنزيمهاي تحديدي را در خود دارد. براي تكثيز پلاسميد فوق از باكتري اشديشياكلي استفاده مي گردد.
• براي برش آنزيمي اين پلاسميد ابتدا باكتري حاوي اين پلاسميد را تكثير ميدهد. در ضمن تكثير باكتري پلاسميد مورد نظر در باكتري همانندسازي كرده و تعداد آن افزايش مي يابد. براي تكثير باكتري از كشت آن در ml2 محيط LB حاوي ng/ml50 آنتي بيوتيك آمپي سيلين استفاده مي شود. پس از 18 ساعت كشت مورد نظر كدورت مناسب را پيدا ميكند. پس از آن پلاسميد از باكتري تخليص ميگردد.

مواد:

1- SET buffer:

Sucrose                               50mM

EDTA                                 10mM

Tris-Hcl  pH 8                    15mM

2- بافر ليزكننده:

Lysis Buffer (1ml)

Na OH (2N)                        100ml

SDS (10%)                         100ml

DDW                                  800ml

3- استات پتاسيم 5 مولار با pH 4.2

Potassiun Acetate 5M         for 100ml

KAC (4M)                          60ml

Acetic Acid                         11.5ml

DDW                                  28.5ml

روش:

ابتدا 5/1 ميلي ليتر از كشت 18 ساعت باكتري را با استفاده از سانتريفوژ با دور rpm4000 بمدت 5 دقيقه رسوب ميدهيم. سپس رسوب بدست آمده را در 100ml از SET buffer كاملاً حل كرده بمدت 5 دقيقه در حرارت اتاق قرار مي دهيم. پس از مدت فوق ml200 از محلول ليز بافر تازه تهيه شده را در رسوب سوسپانسيون فوق ريخته، بخوبي مخلوط كرده و بمدت 2 دقيقه در يخ قرار ميدهيم. سپي ml150 از محلول KAC بر نخلوط فوق ريخته پس از مخلوط نمودن مجدداً بمدت 5 دقيقه در يخ ميگذاريم.

جهت تفكيك پروتئينهاي آزادشده سلولي از DNA پلاسميد ml450 از تركيب فنل-كلروفرم – ايزوآميل الكل (1/24/25) بر سوسپانسيون حاوي

تحقیق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7L12 و P39 در موشهاي Balac