پايان نامه استخراج،جداسازي وتعيين ميزان آلكالوئيدهاي تروپان در گياه
عنوان پايان نامه׃
استخراج،جداسازي وتعيين ميزان آ لكالوئيدهاي تروپان در گياهHyoscyamus niger L. تيمار شده با غلظت هاي مختلف نيترات در مراحل مختلف رشد
چكيده
هيوسياموس نيگر يك گياه دارويي مهم ، متعلق به تيره سيب زميني است. اين گياه منبع غني از مواد دارويي از جمله آلكالوئيدهاي تروپاني است. دراين تحقيق ما اثرات غلظت هاي مختلف نيترات (0,0.06,0.12,0.18,0.23,0.31,0.36گرم) را روي رشدگياه وتوليد آلكالوئيدهاي تروپاني مطالعه كرديم .بعد از استخراج آلكالوئيد هاي تروپاني٬آن ها بوسيله TLC آناليز شدند .نتايج حاصل از TLCنشان دادند كه ريشه ها بيشترين مقدار هيوسيامين واسكوپولامين را داشتند،هم چنين در ريشه ها وبرگ ها هيوسيامين ،آلكالوئيد عمده بود . افزايش غلظت نيترات، موجب كاهش بيوسنتز آلكالوئيد هاي تروپاني شد. گياهان تيمار شده با نيترات،بيشترين وزن خشك ووزن تر را نشان دادند.
مقدمه
گياهان دارويي منابعي غني از متابوليت هاي ثانويه هستند. در ميان متابوليت هاي ثانويه گياهان٬ آلكالوئيد ها گروه مهمي را تشكيل مي دهند .گروهي از آلكالوئيدها به نام آلكالوئيدهاي تروپان به طور عمده در گياهان تيره سيب زميني يافت مي شوند. (5و6و31).آلكالوئيدهاي تروپاني اهميت دارويي خاصي دارندآن ها تركيباتي با انواع اثرات دارويي هستند(31).از شناخته شده ترين آلكالوئيدهاي تروپاني مي توان هيوسيامين1 ،اسكوپولامين2 وآتروپين3 را نام برد . آتروپين مخلوط راسميك- L,D هيوسامين مي باشد كه از راسميزاسيون هيوسيامين به ايزومر چپ گرد آن نسبت داده مي شوند .اسكوپولامين چپ گرد به هيوسين نيز معروف مي باشد(5) .هيوسيامين واسكوپولامين به عنوان داروهاي مهار كننده اعصاب پاراسمپاتيك ودر واقع ناسازگار رقابتي استيل كولين در گيرنده هاي موسكاريني مي باشند (27) .هيوسيامين در درمان بيماري هاي اعصاب وروان ونيز در تهيه داروهاي ضد تهوع ودريا زدگي كاربرد فراواني دارد.و داراي اثر باز كننده مردمك چشم به نحو سريع وقوي دارد.اسكوپولامين داراي خاصيت آرام كننده سلسله عصبي با اثر بسيار قوي هست وازآ ن ها براي تسكين ناراحتي هاي عصبي وپاركينسون ولرزش هاي زمان كهولت استفاده به عمل مي آيد (2و8).هدف از اين تحقيق ،استخراج واندازه گيري آلكالوئيدهاي تروپاني هيوسيامين واسكوپولامين موجود در گياه Hyoscyamus niger L. مي باشد.
فصل اول
بررسي منابع
1–1-جایگاه گياه در رده بندی گیاهی (7)
شاخه: پیدازدان (Spermatophyta)
زیر شاخه: نهاندانگان (Angiosperms)
رده: دو لپه ای (Dicotyledoneae)
زیر رده: پیوسته گلبرگ ها (Gamopetalae)
راسته: پلومونیال (Polemoniales)
تیره: سیب زمینی (Solanaceae)
جنس: هیوسیاموس (Hyoscyamus)
گونه: (Hyoscyamus niger L.)
1-1-1-ویژگی های گياه شناسي L. Hyoscyamus niger
گیاهی علفی، یک ساله یا دو ساله، پوشیده از کرک و غده، ساقه ها از نیمه منشعب، ضخیم، به ارتفاع 20 تا 100 حداکثر 150 سانتی متر است. برگ های قاعده ای تخم مرغی- نیزه ای، به طول 5 تا 25 و عرض 2 تا 8 سانتی متر، سطح بالايي و پاييني دارای پوشش کرکی، قاعده برگ ها ممتد و بدون دم برگ، برگ های ساقه ای بدون دم برگ و ساقه آغوش، دارای بریدگی تا بدون بریدگی، پوشیده از کرک های بلند همراه با غده،برگ ها متناوب. گل آذین خوشه، دم عقربی، بعد از گل دهی کشیده و افراشته، برگه ها درشت، دم گل نسبتاً کوتاه و حداکثر 2 تا 3 میلی متر، کاسه گل به طول 10 تا 15 میلی متر و در حالت میوه 20 تا 40 میلی متر، در وسط کمی پیچ خورده و در قاعده متورم و دارای کرک های بلند، دندانه های کاسه مساوی، مثلثی، نوک تیز و کوتاه، جام گل به رنگ زرد چرک تا بنفش با برگه های بنفش تیره، به طول 5/2 تا 5/3 سانتی متر، لبه ها مساوی، سطح خارجی دارای پوشش کرکی کوتاه همراه با غده، پرچم ها کوتاه تر از جام گل؛ بساک ارغوانی. میوه کپسول به طول تا 20 میلی متر و محتوی 400 تا 500دانه كوچك است. دانه سیاه، تزیینات پوسته دانه چاله دار و دارای غده(4). بعضی پایه های آن متجاوز از 1000 دانه بوجود می آورند که هر یک از آنها می تواند مدتی دراز بدون آن که بروید در زمین باقی بماند. ریشه ای راست، دراز و نسبتاً ضخیم دارد. (5).
1-2-پراکندگی جغرافیایی درجهان ودر ايران
تمامی نیم کره شمالی از جمله اروپا، ترکیه، روسیه، قفقاز، آسیای میانه، سیبری، افغانستان، پاکستان، عراق و شمال آفریقا (4)
درشمال، شمال غرب، غرب، مرکز، شمال شرق و شرق ايران(4).
1-3-مکان های رویش بنگ دانه
بنگ دانه معمولاً در کنار جاده ها، اماکن مخروبه، حاشيه كشت زارها و نواحی بایر غالب نقاط اروپا مانند یوگسلاوی، منطقه مدیترانه و نقاط مرکزی و غربی آسیا مانند ایران و هم چنین در شمال آفریقا می روید(5).
1-4-اهميت گياهان دارويي
طی سالیان متمادی داروهای طبیعی، خصوصاً گیاهان دارویی اساس و حتی در برخی موارد تنها طریق درمان بيماري ها محسوب می شدند و در عین حال مواد اولیة موجود در آنها در صنعت دارو سازی نيز مورد استفاده قرار می گرفت(1).
باتوسعه سریع داروهای سنتتیک در پنجاه سال اخیر،استفاده از گیاهان دارویی تا اندازه ای منسوخ شده بود.ولی به علت ظاهر شدن عوارض نا مطلوب وجانبی ترکیبات سنتتیک وعدم سازگاری آنها با طبیعت انسان، بار دیگر توجه دانشمندان ومحققین به گیاه درمانی ومواد موثرموجود در گیاهان دارویی معطوف گردید (6).
کشت گیاهان دارویی در حال حاضر شاخه مهمی از کشاورزی و منبع اصلی توليد واستخراج مواد اولیه ساخت داروهای موجود به شمار می رود. به این ترتیب ملاحظه می شود که هیچ زمانی توجه به گیاهان دارویی و اثرات واستفاده ازآنهاکاملاً گسسته نشده است(1).
چون مواد موثرة موجود در داروهای گیاهی به دلیل همراه بودن آنها با مواد دیگر از حالت تعادل بیولوژیک برخوردارند لذا در بدن انباشته نمی شوند و اثرات جانبی به بار نمی آورند .کاربرد گیاهان در داروسازی وجایگزین کردنآن ها بامواد دارويي سنتتيك دراروپا روز به روز افزایش یافته و نتايج حاصل از اين امر مثبت بوده است لازم به ياد آوري است که بسیاری از کشور های آسیایی و اروپایی خصوصاً کشورهایی که این علم در آنها از سابقه بیشتری برخوردار است (به ويژه کشور چین) تحقیقات وسیع و دامنه داری را در این زمینه شروع و انواع متنوعی از این داروها را به بازار عرضه کرده اند که اثرات مثبت آن ها مورد تائید همگان قرار گرفته است(1).
1-5-خواص درمانی بنگ دانه
بنگ دانه اثر ضد تشنج، آرام کننده درد، مخدر، باز کننده مردمک چشم و خواب آور دارد. از بنگ دانه در بیماری های دستگاه تنفسی مانند سرفه های تشنجی، سیاه سرفه، سل، برونشیت مزمن، دردهای عصبی، درد مفاصل، رماتیسم، نقرس، احساس چنگ زنی در معده، قولنج ها، دردهای بامنشا ورم روده، تحریکات معزی، صرع، بیماری های دماغی همراه با هیجانات بی خوابی و همچنین به علت دارا بودن هیوسیامین زیاد، در بیماری های پارکینسون، استفاده به عمل می آید(5).
1-6-ترکیبات شیمیایی بنگ دانه
مقدار کلی آلکالوئیدهای بنگ دانه بر حسب شرایط محیط تغییر می کند ولی در هر حال مقدار نسبی آنهااز ميزان آلكالوئيد هاي شابيزك (Atropa) کمتر است. بنگ دانه دارای مخلوطی از آلکالوئیدهای مهم مانندهیوسیامین [1]، اسکوپولامین[2] و به مقدار کمتر آتروپین[3] است(5).
مقدار کلی آلکالوئیدهای دانه بنگ دانه، معادل 110/ تا 140/ درصد است. دانه بنگ دانه علاوه بر آلکالوئیدهاي مذکور، دارای 20 تا 30 درصد روغن قابل استخراج، به رنگ زرد مایل به سبز و 30 درصد نشاسته می باشد. در برگ بنگ دانه نیز مقدار کلی آلکالوئیدها در حدود مقدار آلکالوئیدهای دانه گياه است(5).
همه اندام های رویشی گیاه محتوی آلکالوئیدهای تروپانی هستند. ریشه ها محتوی 18/0- 15/0 درصد، برگ ها 1/0 درصد، ساقه ها در حدود 02/0 درصدو دانه ها در حدود 1/0 درصد آلکالوئید هستند(9)
شکل یک سالهL. Hyscyamus niger. مواد فعال کمتری از شکل دوساله آن دارد.گلیکوزید ها نیز در گیاه همراه با فلاونوگلیکوزیدها[4] نظیر کوئرستین[5]، اسپیرئوسید[6]، هیپروسید[7] و روتین[8] یافت شده اند. گیاه دارای برخی
چكيده………………………………………………………………………………………………………1
مقدمه………………………………………………………………………………………………………..2
فصل اول/ بررسي منابع
1-1-جايگاه گياه در رده بندي گياهي
1-1-1-ویژگی های گياه شناسي L. Hyoscyamus niger
1-2-پراکندگی جغرافیایی درجهان ودر ايران
1-3-مکان های رویش بنگ دانه
1-4-اهميت گياهان دارويي
1-5-خواص درمانی بنگ دانه
1-6-ترکیبات شیمیایی بنگ دانه
1-7-1-پراکندگی آلکالوئیدها
1-7-2-نقش بوم شناختي آلکالوئیدها
1-7-3- دسته بندی آلکائولیدها
1-8- آلکالوئیدهاي تروپاني
1-8-1-بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها
1-8-1-1-بیوسنتز نمک 1- متیل- پیرولینیوم
1-8-1-2-تشکیل حلقه تروپان
1-8-1-3-احیای تروپینون
1-8-1-4-تشکیل اسکوپولامین
1-8-2-جایگاه بیوسنتز و ذخیره آلکالوئیدهاي تروپاني
1-8-3-ویژگی های اسکوپولامین، هیوسیامین و آتروپین
1-8-4-اهمیت دارویی آلکالوئیدهاي تروپاني
فصل دوم/مواد وروش ها
2-1-آماده سازي محيط كشت
2-2-کشت بذر
2-3-تیمار دهی
2-4- برداشت
2-5-روش استخراج آلکالوئیدها
2-6-تعیین وجود و شناسایی آلکالوئیدها
2-6-1- استفاده از روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) Thin Layer Chromatography
2-7-سنجش کمی آلکالوئیدها
2-7-1- جداسازی تروپان آلکالوئیدها
2-8- طرح آزمایشی و تجزیه و تحلیل داده ها
فصل سوم/نتايج
3-1-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هیوسیامین برگ
3-2-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هیوسیامین ریشه
3-3-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هیوسین برگ
3-4- نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هیوسین ریشه
3-5-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان وزن تر برگ ها
3-6-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان وزن خشک برگ ها
3-7-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان وزن تر ریشه ها
3-8-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان وزن خشک ریشه
3-9-نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسيامين برگ ها وريشه هادر13هفته بعد از كشت
3-10-نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسيامين برگ ها وريشه ها در16 هفته بعد از كشت
3-11-نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسيامين برگ ها وريشه ها در21 هفته بعد از كشت
3-12- نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسين برگ ها وريشه ها در13 هفته بعد از كشت
3-13- نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسين برگ ها وريشه ها در16 هفته بعد از كشت
3-14- نتايج حاصل از مقايسه ميزان هيوسين برگ ها وريشه ها در21 هفته بعد از كشت
3-15- نتايج حاصل ازمقايسه ميزان هيوسيامين برگ دربين برداشت هاي مختلف
3-16- نتايج حاصل ازمقايسه ميزان هيوسيامين ريشه دربين برداشت هاي مختلف
3-17- نتايج حاصل ازمقايسه ميزان هيوسين برگ دربين برداشت هاي مختلف
3-18-نتايج حاصل ازمقايسه ميزان هيوسين ريشه دربين برداشت هاي مختلف
3-19-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هيوسيامين كل
3–20–نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان هيوسين كل
3-21-نتايج حاصل از اندازه گيري ميزان آلكالوئيدكل
3-22-نتايج حاصل از مقايسه هيوسيامين وهيوسين كل
فصل چهارم/تفسير نتايج
-1-4-تفسير نتايج حاصل از تاثير نيترات بر ميزان آلكالوئيد هاي تروپاني برگ ها وريشه
2-4-تفسير نتايج حاصل از تاثير نيترات بر مقدار هيوسيامين و هيوسين برگ و ريشه
3-4-تفسیر نتایج حاصل از مقایسه مقادیر هیوسیامین کل، هیوسین کل و آلكالوئيد کل
پيشنهادات
منابع
فهرست جداول
جدول 1-1- غلظت های نیترات عرضه شده به محیط کشت گیاهان
جدول 3-1-مقادیر هیوسیامین برگ در برداشت های مختلف
جدول3-2- مقادیر مربوط به هیوسیامین ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-3-مقادیر هیوسین برگ در برداشت های مختلف
جدول 3-4- مقادیر مربوط به هیوسین ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-5- میانگین های وزن تربرگ در برداشت های مختلف
جدول 3-6- میانگین های وزن خشك برگ در برداشت های مختلف
جدول 3-7 مقادیر وزن تر ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-8 مقادیر وزن خشک ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-9 مقادير هيوسيامين اندام هاي برگ و ريشه گياهان برداشت شده در13هفته بعدازكشت
جدول 3-10- مقادير هيوسيامين اندامهاي برگ و ريشه در برداشت دوم
جدول3-11 مقدار هيوسيامين اندام هاي برگ و ريشه در برداشت سوم
جدول 3-12 مقدارهیوسین اندام هاي برگ و ريشه در برداشت اول
جدول 3-13 مقدارهیوسین اندامهاي برگ و ريشه برداشت دوم
جدول 3-14 مقدارهیوسین اندام هاي برگ و ريشه در برداشت سوم
جدول 3-15 مقایسه مقادیر هیوسیامین برگ دربين برداشت های مختلف
جدول 3-16- مقادیر مربوط به مقایسه هیوسیامین ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-17 مقایسه مقادیر هیوسین برگ در برداشت های مختلف
جدول 3-18- مقادیر مربوط به هیوسین ریشه در برداشت های مختلف
جدول 3-19- مقادیر مربوط به هیوسیامین کل در برداشت های مختلف
جدول 3-20- مقادیر مربوط به هیوسین کل دربرداشت هاي مختلف
جدول 3-21- مقادیر مربوط به آلکالوئید کل در برداشت های مختلف
جدول3-22-مقادير مربوط به هيوسيامين كل وهيوسين كل در 13 هفته بعد كشت
جدول3-23-مقادير مربوط به هيوسيامين وهيوسين در 16 هفته بعد كشت
جدول3-24-مقادير مربوط به هيوسيامين وهيوسين در 21 هفته بعد كشت
فهرست اشكال
شكل 1-1-مسير بوسنتزي هيوسيامين واسكوپولامين
شكل1-2-مسير بيوسنتزي اسكوپولامين از هيوسيامين
شكل 2-1- منحنی استاندارد اسکوپولامین هیدروبروماید رسم شده با اسپکتروفتومتر
شكل2-2 – منحنی استاتدارد آتروپین سولفات رسم شده با اسپکتروفتومتر