تحقیق و پژوهش تکنیک های ژنتیک

مبناي  تكنيك هاي ژنتيك

تكنيكهاي فني ژنتيكي بعد از شناسايي كامل DNA از سال 1953 آغاز شد بعد با كشف حكم مركزي در سال 1958 توسط فرانسيس كريك اتفاق اتفاد. ژنتيك وارد مسيري تازه شد كه هدف آن درك پنج الگوي رفتاري سلولي رشد تقسيم تمايز، حركت و ميانكش است.

ميزان پيشرفت در اين زمينه باعث بهت و حيرت و حتي خوپش بين ترين دانشمندان باشد بطور روزانه كشفيات بدست آمده از آزمايشگاههاي تحقيقاتي خبر از شناسايي ژن هاي جديد عامل بيماري ها يا محصولات بيوتكنولوژي نويد بخش مي دهند اكثر كشفيات مهم ژنتيكي با استفاده از ساده ترين موجودات ( ويرو ها ، باكتري ها) بدست آمده اند اگر چه امروزه يافته هاي جديد در مورد گياهان و پستانداران نيز ارائه شده است. اگر چه باكتري ها و باكتريوفاژ ها هنوز هم پيچيده هستند اما نسبت به سلولهاي جانوري و گياهي سيستم ساده تري دارند، با استفاده از اين سيستم هاي ساده بود كه دانشمندان توانستند DNA را بعنوان مولكول حاوي اطلاعات ژنتيكي يك سلول معرفي كنند.

DNA در سال 1869 توسط ميكشن در اسپرم ماهي شناسايي شد ولي عملكرد و اهميت آن در سلول به عنوان مسئول صفات توارثتا قرن اخير نا شناخته ماند ساختار فيزيكوشيميايي DNA توسط واتسون و كريك بدست آمد .

با فاصله زماني كوتاه بعد ازشناسايي DNA ساختار DNA شناخته شد كه به عنوان ماكرو مولكول حد واسط مهم در نستز آنزيمها و ساير پروتئين ها عمل مي كند.

بدنبال اين كشفيات شاخه جديد بنام ژنتيك مولكولي در اواخر دهه 1950 و اوايل دهه 1960 بوجود آمد كه مفاهيم جديد را معرفي كرد موفقيت هاي اوليه و تجمع مقدار انبوه اطلاعات دانشمندان را قادر ساخت تا تكنيك هاي قوي و روش هاي منطقي را براي موضوعات گوناگون ژنتيك مولكولي و عملكرد عصب، عضله- عملكرد آنتي بيوتيك… ) ارائه دهند.

اعتقاد به يك شكل ذاتي فرآيند هاي زيستي يك فاكتور مهم در زمينه رشد سريع شاخه ژنتيك مولكولي بر دانشمندان معتقد هستند كه ساختار اصول بيولوژيكي كه فعاليت ارگانيسم هاي ساده را هدايت مي كند در مورد سلول هاي پيچيده نيز صادق هستند و فقط در يك سري جزئيات تفاوت دارند كه اين نظريه با يك سري نتايج آزمايشگاهي بدست آمده نيز مورد تائيد قرار گرفت.

ساختار DNA:

ساختمان DNA پلي است كه از تعداد زيادي نوكلئوتيد ساخته شده فرق نوكلوئيد ها در بازنيتروژن داراست دانشمندي به نام Charaff با امكانات ساده مقدار G,A . C,T را در موجودات مختلف استخراج كرد و مقدار نسبي آن را حساب كرد و نتايجي گرفت. ديدار همه DNA هاي دو رشته اي و همواره است.

خانم فرانكلين و ويل كين DNA را استخراج كرده و از طريق اشعه x‌متوجه شدند DNA دو رشته اي است اما سرانجام Watson و crick   در سال 1953 مدل DNA را ارائه دادند و گفتند كه مولكول DNA مولكولي دو رشته اي است و مارپيچ Doulde Helix علت مارپيچ DNA است و جفت نوكلئويد ها با هم زاويه دارند.

اندازه زاويه هر جفت را 36 محاسبه كردند و اثبات كردند كه در هر 10 نوكلئوتيد وجود دارد طول هر DNA A 34 درجه هر چفت باز nm 0.34 در نتيجه زاويه هاي وپيچ ها داراي شيار بزرگ و كوچك است به آن قسمتي از DNA است كه اگر ازبيرون به آن بنگريم جفت نوكلئوتيدها را مي بينيم اين شيارها محل اتصال هستند اين شيار به وسيله پروتئين هايي به آنها متصلند نقش مهمي در ميان ژن ها دارند.

علت ايجاد شيار:

نيروهاي موجود در DNA از نوع هيدروژني ، هيدروفوب DNA به فرمهاي B,Z,A وجود دارد. فرم A در سلول وجود ندارد و از آبگيري B- DNA بدست مي آيند در يك A- DNA در هر دور بجاي 10 تانوكلئوتيد وجود دارد و قطري بجاي 23A-20A درجه است مثل B- DNA راست گرد زاويه حدود 34 است در اينجا هم شيار بزرگ و كوچك وجود دارد.

ما در سلول هيريد RNA- DNA را مشابه A- DNA داريم.

فرم B- DNA همان فرم است كه واتسون و كريك شرح دادند و فرم شايع DNA در سلول است اما فرم 2 در مناطقي از DNA تشكيل مي شود كه G-C فراوان دارند خيلي باريك است قطر 18A است و در هر دو جفت نوكلئوتيد دارند و تنها DNA چپ گرد است و فقط شيار كوچك دارد و طرف ديگر صاف است در طول هر دو 45A است.

فرم هاي D,E,C هم فقط در شرايط آزمايشگاه ساخته شده اند.

فرم DNA:

DNAبصورت حلقوي – خطي تك رشته اي و دو رشته اي مارپيچ وجود دارد. رشته الگوي آن Coding نام دارد و رشته ديگر Non coding  نام دارد.

وقتي در DNA تعداد دورها با تعداد دفعات كه يك رشته DNA و RNA ديگر را قطع مي كند مساوي باشد يعني در حقيقت DNA  بر روي DNA باشد نه رشته بر روي رشته حالت supyeoil داريم حالت چپ گرد سوپركويل به فرم فعال DNA نزديك است در تكنيك هاي جديدي از آنزيم هاي توپوايز كه در تبديل حالات سوپر كويل از چپ به راست يا حالت خنثي استفاده مي كنند.

دسته بندي DNA

فشرده كردن DNA در فضاهاي كوچكتر از خود DNA بسته بندي DNA مي گويند كه دريوكاريوتها اهميت بيشتري دارد.

در اين كار بوسيله پروفين هايي انجام مي شود. پروتن هاي هيستون كه شديدا قليايي هستند (ليزين و آرژنين زياد دارند) در اين كار نقش عمده اي دارند اين پروتين ها شامل Hn , H₃ ,H₂B ,H₂A, H₁  هستند مولكولها ي حفظ شده در تمام گونه ها هستند كه در مقابل موتاسيون ها ازبين نرفته اند و اين دليل بر حساسيت كار آنها است و در نهايت كار بسته بندي DNA شكل كروموزوم بوجود مي آيد كه در مرحله مستافاز بهترين فشردگي ديده مي شود.

يا غلظت نمك كم ساختماني ديده مي شود كه قطر آن 10nm است و شبيه گردن بند تسبيح مانند است و // كه بين دانه هاي تسبح قرار دارند را مي توان DNA هضم كرد پي برد كه اينكه DNA است دانه اي روي گردنبند را نوكلئورد گويند كه داراي پروتئين هاي هيستون است. در غلظت نمك بال گردنبند يك شكل پيچيده به نام سولئوئيد به خود مي گيرد كه قطر آن 30nm است و بعد از حالت سلنوتندي كروموزوم در نتيجه پيچش بيشتر رخ ميد هد.

توالي هاي DNA:

بيشتر توالي هاي DNA  Noncoding هستند درصد كمي از ژنوم انسان بيان مي شود كه به آنها كودينگ مي گويند و مابرخي از توالي هادر DNA اشاره مي كنيم.

فاميل هاي ژني پراكنده :

اين توالي ها تكراري و فعال هستند انواع متعددي از پروئن ها بوسيله فاميلهاي ژني همولوگ كه در سرتا سر ژنوم پراكنده شده اند كه مي شوند چنين فاميله ايي داراي چند ژن و يا تعداد بسياري ژن هستند مثل آكتين ها ( 5 تا 30 ژن)

كواتين ها ( بيش از 20 ژن) و هستيرتما ( 100 تا 1000 ژن) ژن هاي همولوگ متفاوت ممكن است وظايف نسبتاً متفاوتي داشته باشند بعضي از ژن هاي درون فاميل ممكن است فعال نباشند و لذا سبب ژن هاي كاذب رونويسي شده شود.

رشته فاميل هاي ژني پشت سر هم:

فاميل هاي در اين ژنها بصورت رشته اي پشت سر هم قرار گرفته اند مثل سازمان دهنده هستك(No ) امروزه مشخص شده كه No بر روي كروموزم هاي x,y مكش ميوه به ترتيب داراي 150 تا 250 نسخه پشت سر هم از ژنهاي rRND مي باشد. يا مثال ديگر tRNA

توالي هاي فعال فاقد كد:

تلومرها، داراي رشته هاي پشت سر هم ساده اي از توالي هاي DNA هستند كه RNA و يا محصول پروتئيني را كه نمي كشند اما وظيفه معيني دارند مثلا در تاژك تكراري از توالي TTGGGG در انسان تكراري از توالي TTAGGG وجود دارد.

توالي هايي كه وظيفه آن ها معلوم نيست:

اين توالي ها نسخه هاي بيشتري در ژنوم نسبت به توالي هاي فعال هستند اندازه آن در ژنوم تعجب آور است مثلا در انسان حدود %20 از ژنوم انسان است و اين توالي ها به سه دسته تقسيم مي شوند.

• DNA سانترامري با تكرار زياد:

هنگاميكه DNA ژنومي براي مدت طولاني در شيب كريد سديم در ساير هويژ قرار مي گيرد DNA بصورت يك باند قابل رويت در مي آيد اما باندها ماهواره اي نيز مشاهده مي شوند كه متمايز از باند اصلي DNA هستند چنين DNA‌ هايي ماهواره اي را چندين تكرار پشت سر هم از توالي هاي نوكلئوتيدي كوتاه هستند كه اگر باز شوند طول آنها صدها كيلو باز خواهد شد. هنگاميكه از چنين توالي هاي ساده اي DNA كاوشگر تهيه مي شود براي نشانه گذاري كروموزوم از آن استفاده مي شود مشاهده مي شود كه حجم زيادي از DNA ماهواره اي  ناحيه هتروكروماتين قرار دارد كه مجاور سانتي و مراست تعداد واحد هاي تكراري يك يا چند تا است كه معمولا طول آنها كمتر از 10 بار است.

• VNTR : يك دسته بخصوص از تكرارهاي پشت سر هم تعداد متغيري را در مكانهاي كروموزومي متفاوت در اعضاي انفرادي يك گونه شان مي دهد اين نوع تكرار را تكرار پشت سر هم با تعداد متغير VNTR‌و بعضي اوقات DNA ماهوارك مي گويند اين مكان ها در انسان توالي هايي يك تا پنج كيلو باز هستند كه شامل تعداد متغيري از واحدهاي تكراري با طول 15 تا 100 نوكلوئيد مي باشد. روش هايي مخصوص توالي VNTR‌است كه در پزشكي قانوني كاربرد فراوان دارد. و از اين نوع DNA براي تهيه نشانگرهاي مولكولي بمنظور نقشه يابي درژنوم انسان و ساير موجودات استفاده مي شود.
• توالي هاي جابجا شده:

بخش A زيادي از ژنوم يوكاريوتها داراي اين توالي هستند كه از طريق رونويسي خود در داخل ژنوم تكثير شده اند و مي توانند به محل هاي جديد حركت كنند اين عناصر را در مجموع توالي هاي جابجا شده گويند. (ترانس پوزون) بسياري از ژنومها داراي چندين نسخه از چنين عناصري هستند و يا انيكه نگارشهاي ناقصي از آنها در سراسر ژنوم پراكنده شده است. دسته ديگر توالي هاي جابجا شده رتردترانسپوزونها هستند كه توالي DNA هايي هستند كه از طريق آنزيم ترانس كريتاز معكوس خود را تكثير مي كنند. نوع ديگر مربوط به رتردوويروسهاست. از طريق نسخه برداري RNA‌آنها به DNA جابجا مي شود و سپس به سراسر ژنوم معلق مي شود.

عناصر پرانده بينابيني پستانداران عناصري هستند غير ويروسي و برگشتي، با طول يك تا 5 كيلو باز تعداد 20 هزار تا 40 هزار آنها در ژنوم انسان و جود دارند توالي هاي Alu نيز داراي ناحيه هدف آنزيم برشي به اسم Alu ناقص و كامل مي باشد اين توالي ها بين ژن ها در درون اينترونها پراكنده شده و 5 درصد از DNA انسان را تشكيل مي دهند اين توالي بطور كامل حدود 200 نوكلئويد طول دارد، شباهت قابل ملاحظه اي از VSLRNA را احتمالا توالي هاي Alu بصورت نسخه هاي معكو از اين مولكول ها RNA ناشي مي شوند تكرارهاي پراكنده كوتاه بنيابيني مثل ALU را SINES‌گويند. نمونه ديگري از اين عناصر تكرارهاي ژن هاي كاذب هستند كه توسط فرآيند رونويسي معكوس به وجود آمده اند و شامل انتيرون نبتند.

DNA‌فاصله دهنده:

دسته نهايي DNA‌. DNAي حد فاصل است كه عبارت است از آنچه كه بعد از شناسائي كليه واحدها باقي مي ماند اطلاعات چنداني درباره DNA‌حد فاصل وجود ندارد احتمالا تنها وظيفه اين DNA‌فاصله دادن است وجود DNA هاي كه وظيفه آنها معلوم نيست يكي از مجهولات پژوهشگران ژنتيك است عناصر تكراري كه بيشتر DNA هاي غير فعال را بوجود مي آورند در معرض انتخاب طبيعي نيستند اين DNA‌هاي غير فعال را DNA  خود خواه گويند انها نوعي از DNA هستند كه فقط وجود دارند و فنوتيپ خاصي ندارند.

ساختمان فوق العاده كروموزوم:

كروموزوم ها را فقط در جريان تقسيم سلولي مي توان مشاهده كرد اما استفاده از تكنيك هاي بخصوص مي توان آنها را مشاهده كرد كه بصورت رشته پيچيده در طول خود هستند و نظريه هاي متعددي پيرامون اين رشته مطرح شده كه ما به بيان مختصر آن مي پردازيم.

1-مدل چند رشته اي: بر طبق اين مدل هر كروموزوم از چندين رشته ساخته شده است كه از مولكول هاي پروتئين و DNA ساخته شده اند هر كروموزوم از دو كروماتيد تشكيل شده هر كروماتيد نيز از دو رشته كردنما ساخته شده بطور كلي در هر كروموزوم چهار كروموزوم نما وجود دارد.

مدل تك رشته اي: مدل تك رشته اي كروموزوم يك رشته مولكول DNA طويل، پيچيده همراه پروئين هستيون مي باشد براي توضيح اين مدل تايلر در سال 1957 مدل هزار پا را مطرح كرد. بر طبق نظر وي يك اسكلت پروتيني وجود دارد كه از آن در رشته هاي پيچيد DNA مثل پاهاي هزار پا بيرون مي آيد ولي بعدا تايلر مدل خود را به مدل قريزر تغيير داد

تحقیق و پژوهش تکنیک های ژنتیک